Echte tanksterilisatie (echte sterilisatie) is een sterilisatieproces waarbij al het bereide kweekmedium in een bioreactor-fermentor wordt ingevoerd of een ander apparaat, wordt stoom geïntroduceerd om het kweekmedium en de gebruikte apparatuur op te warmen tot de sterilisatietemperatuur, gedurende een bepaalde periode gehandhaafd en vervolgens afgekoeld tot de inentingstemperatuur, zoals weergegeven in figuur 1.
Figuur 1 Schematisch diagram van daadwerkelijke eliminatie
Dit proces wordt ook wel intermitterende sterilisatie of batch-sterilisatie genoemd (ten opzichte van continue sterilisatie).
De sterilisatieoperatie met een volledige tank omvat feitelijk drie processen: verwarming, hittebehoud en koeling. Figuur 2 toont de temperatuurveranderingen tijdens de sterilisatie van het kweekmedium in een volle tank.
afbeelding
Figuur 2 Temperatuurveranderingen tijdens sterilisatie van blikjes
Specifieke stappen voor bliksterilisatie:
1. Tankreinigingsinspectie
Controleer vóór het reinigen of de klepstatus correct is. Let bij het reinigen op of er lekkage is in de apparatuur en leidingen, vooral de koelleidingen.
Controleer of het condenswater in de vergistermantel is afgetapt om er zeker van te zijn dat er geen koelwater in de mantel aanwezig is.
Controleer na het reinigen de binnenkant van de tank om de originele kleur te zien zonder duidelijk vuil.
2. Voorbereiding vóór sterilisatie
Steriliseer het luchtfilter van de vergister en blaas het droog met steriele lucht.
Controleer of de tank drukloos is. Plaats de gereinigde en gekalibreerde elektrode in de tank en sluit de elektrodedraad aan. Controleer of de bodemklep van de tank gesloten is.
Voeg vervolgens de voorbereide materialen toe aan de tank, voeg het benodigde water toe om het volume aan te vullen volgens de procesvereisten, voeg de ontschuimer toe en controleer of er materiaal ontbreekt. Roer na voltooiing om te voorkomen dat de vloeistof bezinkt.
3. Verwarming
(1) Indirecte verwarming
Open tegelijkertijd de uitlaatkleppen van het tanklichaam, schakel tegelijkertijd het koelwater van de mantel uit, open de stoomklep van de mantel of spoel, introduceer stoom in de mantel of spoel om de vloeistof indirect te verwarmen, open de afvoer van de waterinlaatleiding van de mantel een beetje klep, en voer het gecondenseerde water af in het tanklichaam en de mantel.
Wanneer de tanktemperatuur stijgt tot 80-90℃, sluit u geleidelijk de uitlaatklep.
De rol van het voorverwarmen van de mantelstoom:
①Verminder de vorming van gecondenseerd water en zorg voor de nauwkeurigheid van het kweekmediumvolume na desinfectie.
In het begin wordt stoom rechtstreeks in de tank gebracht en wordt het koude materiaal in de tank direct in de stoom geblazen, wat zeer waarschijnlijk een grote hoeveelheid gecondenseerd water zal produceren en het volume van het kweekmedium na consumptie te groot zal maken. . Sommige fabrieken laten deze stap achterwege en moeten de hoeveelheid gecondenseerd water die door experimenten wordt gegenereerd, controleren om de concentratie van het kweekmedium te garanderen.
②Verminder ruis.
Het temperatuurverschil tussen het materiaal en de stoom is te groot en directe introductie van stoom zal trillingen in de apparatuur veroorzaken.
③ Het is bevorderlijk voor de verstijfseling en het vloeibaar maken van zetmeelrijke grondstoffen. (Dit geldt niet voor grondstoffen zonder zetmeel)
De temperatuur van de mantel stijgt relatief langzaam, wat gunstig is voor het volledig oplossen van de materialen die mogelijk niet volledig zijn opgelost in het kweekmedium voor zetmeelrijke materialen, en vermijdt verstijfseling en agglomeratie van het materiaaloppervlak veroorzaakt door een te snelle temperatuurstijging, die beïnvloedt het sterilisatie-effect.
(2) Directe verwarming
Na het voorverwarmen van de mantel tot 80-90 ℃ , sluit u de stoominlaatklep van de mantel (deze kan ook worden gesloten), opent u de stoominlaatklep van de tank en laat u stoom rechtstreeks in de tank stromen om de tanktemperatuur te verhogen tot 118-121 ℃ . Open verschillende uitlaatkleppen en stop met roeren.
4. Warmte- en drukisolatie
Wanneer de materiaaltemperatuur dicht bij de door het proces gespecificeerde temperatuur ligt, verlaagt u geleidelijk de stoomklep en past u de balans van elke klep aan, zodat de druk en temperatuur gestaag de druk en temperatuur bereiken die vereist is voor het proces (in het algemeen iets hoger dan de kweektemperatuur met 0,5-2℃, anders zal het te laag worden).
Op dit moment moeten alle op de reactor aangesloten leidingen zich in twee standen bevinden: stoominlaat of stoomuitlaat, om de leidingen te steriliseren.
Tijdens de isolatiefase moet stoom in alle leidingen onder het vloeistofniveau van het kweekmedium worden gebracht; stoom moet uit andere leidingen boven het vloeistofniveau worden afgevoerd, om een grondige sterilisatie zonder dode hoeken te garanderen. De isolatie is over het algemeen 121℃ gedurende 25-30 minuten.
Algemene gistingstanks hebben over het algemeen drie openingen (luchtinlaatpijp, afvoerpijp en bemonsteringspijp) voor stoominlaat, de zogenaamde "driewegstoominlaat".
"Vierwegstoomuitlaat" betekent dat stoom rechtstreeks wordt afgevoerd uit de uitlaat-, inentings-, toevoer- en ontschuimerleidingen. Vooral op deze vier manieren moeten ook de stoominlaat- en uitlaatkleppen worden geopend.
5. Colling
Sluit na de sterilisatie eerst alle stoominlaatkleppen en verminder de uitlaatklep iets. Open vervolgens de luchtinlaatklep om steriele lucht binnen te laten om de tankdruk op peil te houden. Opgemerkt moet worden dat de druk in de tank lager moet zijn dan de luchtfilterdruk om te voorkomen dat het kweekmedium terugstroomt.
Open ten slotte de koelwaterklep en laat koud water door de mantel of spoel lopen voor snelle afkoeling, begin met roeren en koel het kweekmedium af tot de temperatuur die vereist is voor het fermentatieproces .
Na sterilisatie moet er op tijd steriele lucht worden ingebracht om de druk in de tank te garanderen (doorgaans wordt de tankdruk aangepast op 0,1 MPa) voordat koelwater wordt toegevoegd voor koeling.
De functie van het introduceren van steriele lucht is het versnellen van de koeling en het handhaven van de positieve druk in de tank, om te voorkomen dat de koeling van het kweekmedium een negatieve druk in de tank vormt, die gemakkelijk kan worden geïnfecteerd met bacteriën of ervoor kan zorgen dat de bioreactor vergister beschadigd raken (de tankdruk van de bioreactor-vergister zakt naar nul en het tanklichaam wordt platgezogen). Dit is een ongeval dat vaak voorkomt bij de sterilisatie van fermentatietanks met roestvrijstalen mantel . Dit is een ernstig productie-ongeluk.
De volgende vier criteria worden gebruikt om de kwaliteit van de sterilisatie van kweekmediumtanks te beoordelen:
① Voldoe aan de steriliteitsvereisten na sterilisatie;
②Minder vernietiging van voedingsstoffen;
③ Het volume van het kweekmedium na sterilisatie komt overeen met het volume van het voer;
④Minder schuim.
Tijdens het sterilisatieproces moet op verschillende zaken gelet worden:
(1) De rol van sterilisatieroeren
Bij sterilisatie met een volledig blik speelt roeren een zeer belangrijke rol.
Het doel van het inschakelen van roeren:
① Zorg ervoor dat de gesteriliseerde materialen gelijkmatig worden verwarmd en overgebracht om de vorming van valse druk tijdens het sterilisatieproces van het blik te voorkomen;
② Vermijd materiaalbezinking. Zodra sedimentatie en stratificatie optreden, zal dit een inconsistente verwarmingstemperatuur veroorzaken en gemakkelijk valse druk genereren.
(2) Veranderingen in het vloeistofvolume na sterilisatie
Bij het bereiden van het kweekmedium moet volledig rekening worden gehouden met de toename van het volume van het kweekmedium na sterilisatie.
Hoe langer de sterilisatietijd, hoe meer het volume toeneemt. Hoe lager de temperatuur, hoe groter het volume stoom dat binnenkomt, doorgaans met ongeveer 10%, wat gerelateerd is aan de kwaliteit van de stoom.
De mantel wordt niet of onvoldoende voorverwarmd, het gecondenseerde water in de stoomleiding wordt niet volledig afgevoerd, de stoom die uit de stookruimte wordt gestuurd bevat te veel water, enz., waardoor er veel condenswater zal ontstaan en het volume zal toenemen.
(3) Overweging van de sterilisatietijd van blikjes
Bij industriële fermentatieproductie wordt de fase van hittebehoud gewoonlijk beschouwd als de sterilisatietijd. Nu worden over het algemeen 121℃ en 30min gebruikt.
De sterilisatie-onderhoudstijd die nodig is om hetzelfde sterilisatie-effect te bereiken in fermentoren van verschillende groottes is echter theoretisch verschillend.
De 40m3 bioreactor-fermentor wordt gesteriliseerd en de theoretische sterilisatietijd wordt berekend met de formule
Figuur 4 Bereken de theoretische sterilisatietijd.
t——geeft de theoretische sterilisatietijd aan, s;
N0——het oorspronkelijke aantal levensvatbare bacteriën aan het begin van de sterilisatie (t=0), cellen/ml;
Nt——Aantal resterende levende bacteriën na tijd t, cellen/ml;
k——bacteriële sterftecijferconstante, s-1, die verband houdt met het type micro-organisme en de temperatuur.
Neem aan dat het kweekmedium 2×107 sporen van hittebestendige bacteriën/ml bevat en dat de sterilisatiesnelheidsconstante bij 121 ℃ 0,0287s-1 is.
De tijd die nodig is om de kans op mislukte sterilisatie van 0,001 te verkrijgen, is 23,9 minuten. Er wordt hier geen rekening gehouden met het sterilisatie-effect van de twee fasen van het kweekmedium dat stijgt van kamertemperatuur naar 121 ℃ en daalt van 121 ℃ naar de temperatuur van de fermentatiecultuur .
Verwarming en temperatuurstijging dragen inderdaad bij aan de sterilisatie van het kweekmedium, vooral wanneer het kweekmedium wordt verwarmd tot boven de 100 ℃ is dit effect duidelijker.
Als rekening wordt gehouden met het sterilisatie-effect van het kweekmedium tijdens de verwarmingsfase en als het 15 minuten duurt om de temperatuur van het kweekmedium te verhogen van 100 ℃ naar 121 ℃ , wordt de sterilisatietijd tijdens de isolatiefase berekend op 21,1 minuten en de isolatietijd wordt met 12% verkort.
Hoe groter het volume van de fermentatietank , hoe langer de verwarmingstijd voor tanksterilisatie, hoe groter de impact van de verwarmingsfase op de sterilisatie en hoe korter de overeenkomstige isolatietijd.
Kleine tanks worden snel warm en de opwarmtijd kan worden genegeerd. De fermentatietanks die momenteel in de fermentatie- industrie worden gebruikt, zijn relatief groot (60-100 m3) en er moet rekening worden gehouden met het sterilisatie-effect tijdens de verwarmingsfase om de vernietiging van voedingsstoffen tot een minimum te beperken.
Voor vergistingstanks met een inhoud kleiner dan 40 m3 kan dit effect worden genegeerd.
Daarnaast draagt de koelfase tot op zekere hoogte ook bij aan de sterilisatie, maar tegenwoordig worden vaak snelle koelmaatregelen toegepast, die van korte duur zijn en doorgaans niet in de berekeningen worden meegenomen.
